今天鞋百科给各位分享分子克隆包括哪些步骤的知识，其中也会对求分子克隆具体实验步骤一份~~多谢各位大侠啦~进行解释，如果能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注本站，现在我们开始吧！

求分子**具体实验步骤一份~~多谢各位大侠啦~

分子**实验流程
第一天
一:目的片段的扩增（PCR）
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在。
1.PCR(50ul)
ddH2O 37.5ul
10x buffer 5ul
MgCl2（25mmol） 3ul
dNTP （10mmol） 1ul
primer 1（10mmol） 1ul
primer 2（10mmol） 1ul
cDNA 1ul
Taq 0.5ul
PCR反应条件：
94℃ 5min（94℃ 30s . 55℃ 30s . 72℃ 45s）x30 72℃ 5min.4℃保温 或者
94℃ 5min （94℃ 30s . 64℃ 30s . 72℃ 45s）x10 （94℃ 30s . 66℃ 30s . 72℃ 45s）x10（94℃ 30s . 68℃ 30s . 72℃ 45s）x10 72℃ 5min.4℃保温
注意：当所要扩增的目的片段较大时需要适当的增加延伸时间（一般产物越长，需要的时间越长：　1分钟/1kb）
2.琼脂糖凝胶电泳检测：取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，保存电泳图片。（琼脂糖凝胶的配制:1xTAE缓冲液+琼脂糖 加热至琼脂糖全部溶解然后**至60℃以下加入EB混匀倒板。其中琼脂糖含量为1g/100ml,EB含量为0.1ul/ml）
注：琼脂糖凝胶电泳检测如果有杂带侧需要割胶回收目的片段。
3.PCR产物纯化:根据PCR产物回收试剂盒上流程回收PCR产物,最后用45ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.
4.PCR产物酶切（50ul）
PCR纯化产物 43ul
10xBuffer Tango 5ul
E1 1ul
E2 1ul
酶切反应条件：37℃反应过夜或者37℃反应3-4h。
. PCR产物酶切纯化:根据PCR产物回收试剂盒上流程回收PCR产物,最后用25-30ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.
琼脂糖凝胶电泳检测：取2-5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，保存电泳图片。以确保回收到目的片段。

二．载体的制备
1．质粒DNA的制备：用柱式质粒DNA小量试剂盒抽提我们所要的载体质粒。
2.载体酶切（100ul）
质粒DNA 2ug
10xBuffer Tango 10ul
E1 2ul
E2 2ul
ddH2O 补足至100ul
反应条件：一般pGEX-4T 37℃水浴3-4h，pET系列37℃水浴过夜。
3. 琼脂糖凝胶电泳检测：取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，同时取200ng左右没有酶切的质粒做对照，保存电泳图片。（琼脂糖凝胶的配制:1xTAE缓冲液+琼脂糖 加热至琼脂糖全部溶解然后**至60℃以下加入EB混匀倒板。其中琼脂糖含量为1g/100ml,EB含量为0.1ul/ml）
4.酶切产物纯化：根据PCR产物回收试剂盒上流程回收酶切产物,最后用20-30ul ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.

第二天

三．外源DN**段在质粒载体中的**
1.外源DN**段与质粒载体的连接（10ul）
DN**段 6ul
载体 2ul
T4 DNA Ligase 1ul
Buf T4 DNA Ligase 1ul
反应条件：22℃水浴3-4h或者16℃或4℃水浴过夜。
一般目的片段：载体摩尔比约为3:1，但是在这里我们通常是按体积比。
2.连接产物转化
取全部连接产物加入到不少于5-7倍体积感受态细胞溶液中，冰浴20min，42℃热激90s后静置与冰浴中3-5min加入500-800ul（一般800）LB或SOB培养基，37℃ 200rmp恒温培养0.5-1h。4000rmp离心1min弃上清同时保留100-200ul混匀菌体沉淀后均匀涂布抗性平板上。37℃恒温箱培养过夜。
质粒转化
取质粒1ul或50-100ng加入50-70ul所需的感受态细胞溶液中，冰浴20min，42℃热激90s后静置与冰浴中3-5min加入500-800ul（一般800）LB或SOB培养基，37℃ 200rmp恒温培养0.5-1h。取100-200ul菌体均匀涂布抗性平板上。37℃恒温箱培养过夜。
注：1一定要区分质粒和连接产物转化的不同，不要理所当然。
2根据实验要求选择所需要的感受态。
3在选择抗性平板的时候要根据所选载体和感受态两个方面确定。

第三天

收集涂布的抗性平板检查菌落生长情况4℃保存待下一步实验;筛选鉴定或酶切鉴定

筛选鉴定
菌落 PCR(25ul)
ddH2O 19.2ul
10x buffer 2.5ul
MgCl2（25mmol） 1.5ul
dNTP （10mmol） 0.5ul
primer 1（10mmol） 0.5ul
primer 2（10mmol） 0.5ul
Taq 0.3ul
模板为单菌落
PCR反应条件：
94℃ 5min（94℃ 30s . 55℃ 30s . 72℃ 45s）x30 72℃ 5min.4℃保温 或者
94℃ 5min （94℃ 30s . 64℃ 30s . 72℃ 45s）x10 （94℃ 30s . 66℃ 30s . 72℃ 45s）x10（94℃ 30s . 68℃ 30s . 72℃ 45s）x10 72℃ 5min.4℃保温
注：1一般一个项目要挑选5个单菌落做菌落PCR
2在以菌落为模板时要事先准备相应抗性平板，用*头挑选菌落时要先在事先准备的相应平板上划线标记好顺序再将*头放入上述反应体系中搅匀一下。
3该PCR 的primer 为通用primer 所以在原来目的片段的大小上加上100-200bp。
琼脂糖凝胶电泳检测：取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样，150V恒压电泳20-30min，保存电泳图片。根据大小判断该菌落是否正确。下班前挑取（在划线的板子上）筛选正确的菌体接种到5ml 含相应抗性的LB培养基37℃ 200rmp培养过夜。

请教各位大侠，检测试剂盒的发明专利是不是要写详细的实验步骤?

说明书必须符合专利法26条第3款的要求，即：必须充分公开发明，是否充分公开是以所属技术领域技术人员能否根据说明书实现专利并达到所述技术效果为准。
因此，说明书的公开程度可以根据以上自己把握，但需要记住，如果在实质审查时，审查员提出说明书未充分公开，并且不采纳申请人的申辩，那么是不允许将未记载在原说明书的内容补充进入的，此时，专利申请只能被驳回。
有问题请继续追问

分子**的方法

①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DN**段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级**。②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主复制，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。③柯斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DN**段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。 DNA分子与载体分子连接是**过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DN**段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DN**段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DN**段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。连接反应需注意载体DNA与DN**段的比率。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DN**段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。 ①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。例如：有些λ噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化，如蓝色变为无色；有些λ噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DN**段后便能侵染乙菌，因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子。②间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的**。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的**。④免疫学方法：如果重组**能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的**。

基因**的具体操作步骤是什么?

你好，我现在也正在做分子**，与你共勉~

分子**

选择目的基因，并设计相应引物；（你现在已经有了）

用引物PCR扩增目的基因片段；

选择合适（抗性标记、酶切位点等）的**载体（为了保真扩增），并将PCR片段连接入**载体中；（一般用Taq酶的PCR产物在末尾会自带一个A，可在Solution 1作用下与两端各带一个T的线性T载体直接相连）

将连接产物转化入感受态大肠杆菌，使之在含有抗生素的培养基上生长扩增；

从大肠杆菌中提取质粒（即前面的连接产物），酶切鉴定和测序鉴定均无误后将目的基因片段切下并与新的表达载体连接，然后再次转化入大肠杆菌中扩增，再提质粒，即得到想要的目的基因片段**。

注意**载体和表达载体的区别，**载体可大量扩增而不能表达，表达载体可表达成蛋白但复制的数量少，因此先用**载体大量扩增，再连入表达载体中用于实验。

相同点式两种载体都是质粒。

QQ空间**是什么步骤呀

在百度搜 **空間 ，然後下載，好了後，就打開,按照提示做就行了。

求采纳

简述重组DNA技术的原理及技术。

广义的遗传工程包括细胞水平上的遗传操作（细胞工程）和分子水平上的遗传操作，即重组DNA技术（有人称之为基因工程）。狭义的遗传工程则专指后者。

重组DNA技术来源于两个方面的基础理论研究——限制性核酸内切酶（简称限制酶）和基因载体（简称载体）。限制酶的研究可以追溯到1952年美国分子遗传学家S．E．卢里亚在大肠杆菌中所发现的一种所谓限制现象——从菌株甲的细菌所释放的噬菌体能有效地感染同一菌株的细菌，可是不能有效地感染菌株乙；少数被感染的菌株乙的细菌所释放的同一噬菌体能有效地感染菌株乙可是不能有效地感染菌株甲。经过长期的研究，美国学者W．阿尔伯在1974年终于对这一现象提出了解释，认为通过噬菌体感染而进入细菌细胞的DNA分子能被细菌识别而分解，细菌本身的DNA则由于已被自己所修饰（甲基化）而免于被分解。但有少数噬菌体在没有被分解以前已被修饰了，这些噬菌体经释放后便能有效地感染同一菌株的细菌。被甲（或乙）这一菌株所修饰的噬菌体只能有效地感染甲（或乙），而不能有效地感染乙（或甲），说明各个菌株对于外来DNA的限制作用常常是专一性的。通过进一步的研究发现这种限制现象是由于细菌细胞中具有专一性的限制性核酸内切酶的缘故。

重组DNA技术中所用的载体主要是质粒和温和噬菌体（见转导）两类，而在实际应用中的载体几乎都是经过改造的质粒或温和噬菌体。英国微生物遗传学家W．海斯和美国微生物遗传学家J．莱德伯格等在1952年首先认识到大肠杆菌的F因子（见细菌接合）是染色体外的遗传因子。1953年法国学者P．弗雷德里克等发现大肠杆菌产生大肠杆菌素这一性状为一种染色体外的大肠杆菌素因子所控制。1957年日本学者发现了抗药性质粒。后两类质粒都是在遗传工程中广泛应用的质粒。

重组DNA技术中广泛应用的噬菌体是大肠杆菌的温和噬菌体λ，它是在1951年由美国学者E．莱德伯格等发现的。到70年代初，生物化学研究的进展也为重组DNA技术奠定了基??972年美国的分子生物学家P．伯格等将动物**SV40的DNA与噬菌体P22的DNA连接在一起，构成了第一批重组体DNA分子。1973年美国的分子生物学家S．N．科恩等又将几种不同的外源DNA插入质粒pSC101的DNA中，并进一步将它们引入大肠杆菌中，从而开创了遗传工程的研究。

空间**，怎么**，程序是什么样的

百分之98的网站是打着 “**空间”的幌子的

直接**和亚**的区别

　　亚**是**的成果中进行在培养的过程。两者区别在于亚**为**的再选择过程。
　　**是英文"clone"或"cloning"的音译，而英文"clone"则起源于希腊文"Klone"，原意是指以幼苗或嫩枝插条，以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物，如扦插和嫁接。
　　亚**：(subclone) 分为细胞**和分子**。
　　 在细胞**中，对培养的细胞来说，从原有的**中，再筛选出具有某种特性的细胞进行培养，就是亚**。
　　在分子**中，从大片段的**中选取特定小片段再**。
　　亚**就是初步**的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的DN**段，将目的基因所对应的一小段DNA找出来。
　　对已经获得的目的DN**段进行重新**，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。
　　亚**的基本过程包括：
　　(1)目的DN**段和载体的制备；
　　(2)目的DN**段和载体的连接；
　　(3)连接产物的转化；
　　(4)重组子筛选。